RT-PCR的原理及方法
RT-PCR实验原理及方法
半定量反转录－聚合酶链反应（semi-quantitative reverse transcription and polymerase Chain reaction ,SqRT-PCR）是近年来常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量。以半定量RT-PCR为基础建立起来的mRNA含量测定技术，较含内标化的RT-PCR定量测定的mRNA的方法更为简便可行。
这种方法不另设‘内标准',排除了俩对不同引物之间的相互抑制和灵敏读差异，而且具有明显的剂量－效益关系和良好的重复性。
步骤：
1.抽提总RNA
这种方法不另设‘内标准',排除了俩对不同引物之间的相互抑制和灵敏读差异，而且具有明显的剂量－效益关系和良好的重复性。
步骤：
1.抽提总RNA
2.反转录获得cDNA
3.以cDNA为模板做PCR
注意：
步骤1 RNA抽提质量一定要好，注意污染。
步骤2 内参的选择，常用的有βactin和GAPDH俩中。
步骤3 半定量RT-PCR应该再两管中进行，既内参和目的基因各一管，这样便于控制，做图的时候可以放在一个泳道里跑！指数期和平台期一定要摸清楚！
3.以cDNA为模板做PCR
注意：
步骤1 RNA抽提质量一定要好，注意污染。
步骤2 内参的选择，常用的有βactin和GAPDH俩中。
步骤3 半定量RT-PCR应该再两管中进行，既内参和目的基因各一管，这样便于控制，做图的时候可以放在一个泳道里跑！指数期和平台期一定要摸清楚！
