QPCR注意事项及其重点
技术流程：
RNA提取 ——> 逆转录——>引物设计及引物鉴定——> QPCR——> 数据分析整理
RNA提取 ——> 逆转录——>引物设计及引物鉴定——> QPCR——> 数据分析整理
一、 RNA提取：RNA提取质量必须有保证，RNA完整、蛋白、DNA等杂质少。
二、 逆转录：按照逆转录试剂盒操作一般没问题，要注意的地方是，第一步70度变性后要迅速冰浴2分钟以上，不然会影响逆转录效率。
三、 引物设计：引物设计在QPCR整个技术中至关重要，QPCR引物退火最好在60度左右，引物最好跨越两个外显子，避免DNA污染，扩增片段在300以内，其他条件跟普通PCR差不多。
合成好引物后用普通PCR鉴定引物是否能扩增目的带，有没有非特异性扩增等。
四、 QPCR：主要要求就是上样量准确、重复性好，把握好退火温度，避免引物二聚体。
五、 数据分析：准确判断结果的可靠性及数据整理分析，可靠性主要从重复性、扩增曲线、融解曲线去评价。
二、 逆转录：按照逆转录试剂盒操作一般没问题，要注意的地方是，第一步70度变性后要迅速冰浴2分钟以上，不然会影响逆转录效率。
三、 引物设计：引物设计在QPCR整个技术中至关重要，QPCR引物退火最好在60度左右，引物最好跨越两个外显子，避免DNA污染，扩增片段在300以内，其他条件跟普通PCR差不多。
合成好引物后用普通PCR鉴定引物是否能扩增目的带，有没有非特异性扩增等。
四、 QPCR：主要要求就是上样量准确、重复性好，把握好退火温度，避免引物二聚体。
五、 数据分析：准确判断结果的可靠性及数据整理分析，可靠性主要从重复性、扩增曲线、融解曲线去评价。
